[미생물 정량법 2탄] 총균수 분석법(Direct count) 완벽 정리(feat. Counting chamber)

특정 시료에 포함된 모든 미생물을 계수하는 것은 주로 현미경을 통해 직접 세는 방법으로 이루어집니다. 살아있는 균과 죽어있는 균을 한꺼번에 분석할 수 있는 총균수 분석 방법의 원리와 실험 과정을 정리해 봅니다.

총균수 분석의 기본 원리

총균수 정량(total cell count)은 말 그대로 균이 살아있던 죽어있던 신경 쓰지 않고 모두 다 계수하는 것을 가리킵니다.
여기에서는 미생물을 기준으로 설명할 예정이지만, 세포 배양이나 적혈구 계수 등 다양한 바이오 실험에서 세포 개수를 알아내기 위한 방법으로 사용됩니다.
이번 포스팅에서는 시료 내 모든 세포를 카운팅 챔버(Counting chamber 또는 Hemocytometer)를 사용하여 정량하는 방법을 정리하겠습니다.

직접 계수법(Direct counting method)

생균수 분석법과 같이 균의 개수를 직접적으로 정량하는 직접 측정법(Direct measurements) 중에는 직접 현미경으로 균체를 보면서 세는 방식인 직접 계수법(Direct counting method)이라는 것이 있습니다.
배양해서 집락(Colony)을 관찰하는 생균 측정 방식은 사균(죽어있는 균)이 측정되지 않습니다.
총균수를 측정할 때는 미생물이 살아있는지 여부는 중요하지 않기 때문에 생균과 사균 모두 정량할 수 있도록 육안으로 직접 관찰하며 세는 방법을 사용합니다.

분석의 기본 원리: 카운팅 챔버

총균수의 단위는 일반적으로 cells를 사용합니다. 집락을 생성하는 생균뿐 아니라 사균도 포함되어 있기 때문에 CFU (Colony forming unit)가 아니라 세포의 개수를 직접적으로 표현하는 것입니다. 따라서 시료의 형태에 따라 cells/mL 또는 cells/g과 같은 단위로 분석 결과가 도출됩니다.

액상 시료 내의 총균수를 분석하여 cells/mL로 나타내고 싶다면 균질화된 시료를 일정한 양 채취하여 그 안의 모든 균 개수를 세면 될 것입니다.
하지만 미생물은 매우 작아 육안으로 보기 어려워 현미경으로 보면서 세야 하는데,
슬라이드 위에 고정한 시료에 대해 작은 현미경 렌즈를 옮겨가며 모든 구역을 세는 것은 엄청난 노동력을 요구합니다.
그래서 고안된 실험 기구가 바로 카운팅 챔버입니다.

카운팅 챔버는 위 그림의 왼쪽 위와 같은 모양으로 생겼으며, 일차적으로는 슬라이드 글라스(Slide glass)의 역할을 한다고 생각하면 됩니다.
그 위에 커버 글라스(Cover glass, 그림 왼쪽 아래)를 덮어서 사용하게 되죠. 이때, 카운팅 챔버의 가운데 부분은 약간 높이가 낮게 설계되어 있습니다.
그래서 커버 글라스를 덮으면 이 가운데 부분과 커버 글라스 사이에 약간의 공간(노란색 부분)이 생기게 됩니다.
이 공간에 준비된 시료를 주입하면 모세관 현상으로 가운데 네모 칸에 침투하여 딱 일정량의 부피만 들어가게 만들어 놓은 것입니다.
따라서 주입되는 시료의 부피를 미리 알고 있는 상태로 그 안의 균 수를 셈으로써 단위 부피당 총균수를 정량하게 됩니다.

참고로, 그림에서 시료 주입구라고 표시한 부분에는 작은 홈이 파여 있어 시료를 주입하기 편하게 되어 있는데요.
V-slash라고 표현하는 이 홈은 제품 종류에 따라 없는 경우도 있지만, 그런 경우에도 똑같이 시료를 그 부분에 주입하면 됩니다.
제품 설명에는 시료를 주입하다가 넘치는 현상(Overflow)을 줄일 수 있다는데, 직접 해 본 결과 사람 손이 더 중요했습니다.

카운팅 챔버의 위를 덮는 커버 글라스의 역할은 시료 주입 부분의 높이를 일정하게 만들어 주는 것입니다.
그런데 부피를 계산하려면 가로와 세로 길이도 필요합니다. 그래서 카운팅 챔버에는 일정한 간격의 눈금이 그려져 있습니다.

분홍색으로 표시된 부분을 확대해 보면 위와 같이 수많은 눈금이 있습니다.
이 때 굵은 선으로 이루어진 4×4=16칸으로 된 네모 칸은 한 변의 길이가 1 mm인 정사각형입니다.
그리고 가운데 부분에는 일정 간격으로 나눠진 더 작은 정사각형 네모 칸들이 존재합니다.

측정 대상에 따른 카운팅 챔버의 격자무늬 사용 구역

카운팅 챔버로 직접 계수하게 되는 세포는 다양합니다.
개수를 측정하려는 세포의 크기에 따라 사용하는 구역이 달라질 수 있습니다.

1) 크기가 큰 세포(백혈구, 동물세포 등)
비교적 크기가 큰 세포는 주로 그림의 왼쪽에서 색칠한 네 면을 활용합니다. 특히 동물세포 배양 시 세포의 개수를 셀 때 주로 이 구역에서 측정하곤 합니다.
여기에서 색칠한 면 네 개 중 하나(굵은 선으로 된 단위 정사각형 16칸)의 넓이는 1 mm × 1 mm = 1 mm²가 됩니다.

2) 크기가 작은 세포(적혈구, 효모, 세균 등)
비교적 크기가 작은 세포는 그림의 오른쪽과 같이 중앙 면을 활용합니다.
카운팅 챔버의 중앙 면에 있는 작은 네모 칸의 크기는 앞서 설명한 큰 세포를 세는 네모 칸 구역보다 조금 작게 그려져 있습니다.
중앙 색칠한 면 전체의 넓이는 마찬가지로 1 mm²이지만, 그 안에 굵은 선으로 이루어진 조금 작은 네모 칸은 16칸이 아니라 가로(5칸) × 세로(5칸) = 25칸입니다.
그리고 그 네모 칸이 또다시 가로(4칸) × 세로(4칸) = 16칸의 더 작은 정사각형 네모 칸으로 이루어져 있는 걸 알 수 있습니다.

일반적으로 사용되는 카운팅 챔버의 경우를 예로 든 것입니다.
제품에 따라 네모 칸의 길이와 칸 구성이 달라질 수 있음을 염두에 두고 상황에 맞는 실험을 할 수 있도록 근본 원리를 이해하는 것이 중요합니다.
본 포스팅 내용에서는 상대적으로 크기가 작은 미생물 균체의 정량을 위해 중앙 면을 이용하는 방법을 중점적으로 설명하겠습니다.

카운팅 챔버에 주입되는 부피

앞선 내용에서는 네모 칸의 수와 넓이에 대해 설명했습니다.
그런데 적절한 농도의 분석 시액을 준비하기 위해서는 카운팅 챔버에 액량이 얼마나 주입되는지 알아야 합니다.
안타깝게도 이 양은 하나로 정해져 있는 것이 아니라 카운팅 챔버 제품에 따라 다를 수 있는데요.
일반적으로 제품의 카탈로그를 확인하지 않아도 카운팅 챔버 표면에 해당 정보를 표시해 줍니다. 가령, 아래 그림과 같이 말이죠.

위 그림과 같이 카운팅 챔버 제품 왼쪽 부분에 시료 주입 부분 공간의 높이가 표시되어 있습니다.
(실제 제품 예시는 카운팅 챔버 제품을 보유한 대표 회사 중 하나인 Marienfeld Superior의 제품 페이지에서 확인해 보실 수 있습니다.)
일반적으로 가장 많이 사용하고 본 포스팅에서 설명할 카운팅 챔버는 위와 같이 시료 주입 부분의 깊이가 0.1 mm입니다.
다시 한번 강조하자면, 모든 제품이 같은 높이는 아니니 항상 확인하시기를 바랍니다.

위 그림과 같이 시료가 채워지는 공간의 높이가 0.1 mm라는 것이기 때문에, 앞에서 확인한 네모 칸의 넓이와 이 높이를 곱해주면 해당 부분의 부피를 구할 수 있습니다.
그리고 제품의 왼쪽 아랫부분에 적혀있는 0.0025 mm라는 것은 눈금 중앙 부분의 가장 작은 네모 칸의 넓이를 나타냅니다.
이 내용은 이후 내용에서 자세히 설명해 두었습니다.

그러면 우리가 세균을 관찰하는 데 이용할 눈금 중앙 부분의 부피를 계산해 보겠습니다.

카운팅 챔버의 중앙 부분에는 전체 한 변이 1 mm인 큰 정사각형(A 칸) 안에 굵은 선으로 그려진 한 변이 0.2 mm인 25칸의 중간 정사각형(B 칸)으로 이루어져 있고,
이 B 칸은 각각 한 변이 0.05 mm인 16칸의 작은 정사각형(C 칸)으로 나뉘어져 있습니다.
이제부터 이 정사각형의 네모 칸을 각각 크기가 큰 것부터 A 칸, B 칸, C 칸이라 하겠습니다.
각 네모 칸의 한 변의 길이를 토대로 단면적을 계산해보면 A 칸은 B 칸의 25배, C 칸의 400배가 됩니다.
A 칸의 면적은 1 mm²라고 했으므로, B 칸은1 mm² ÷ 25 = 0.04 mm²이고, C는 1 mm² ÷ 400 = 0.0025 mm²입니다.
그런데 이 0.0025 mm²라는 거 어디서 본 기억이 날 겁니다.
그렇습니다. 바로 저 위에서 카운팅 챔버 아래쪽에 써있는 면적이라는 걸 알 수 있죠.
따라서 카운팅 챔버에 적혀있는 높이와 면적을 곱하면 작은 네모 칸(C 칸)의 시액 부피를 알 수 있는 것이었습니다.

그럼 각 네모 칸의 넓이와 높이를 이용하여 A, B, C의 시액의 부피를 모두 계산해보겠습니다.
A 칸: 1 mm² × 0.1 mm = 0.1 mm³ = 0.0001 mL= 1 × 10^-4 mL 
B 칸: 0.04 mm² × 0.1 mm = 0.004 mm³ = 0.000004 mL = 4 × 10^-6 mL
C 칸: 0.0025 mm² × 0.1 mm = 0.00025 mm³ = 0.00000025 mL = 2.5 × 10^-7 mL

이렇게 부피를 알아냈으니 이제 시액을 주입하고 균체 개수를 세면 mL당 균 수를 다음과 같이 계산할 수 있습니다.
<주입한 시액 1 mL당 균체 수 = 네모 칸 1개당 균체 수 ÷ 네모 칸 1개의 부피>
세균의 크기는 일반적으로 C 칸보다 훨씬 작기 때문에 일정 개수의 C 칸 내부에 존재하는 균체 수를 측정하면 되는데, 만약 그보다 큰 세포일 경우 B 칸을 활용할 수도 있을 것입니다.

총균수 분석 방법(카운팅 챔버 사용)

시료의 적절한 희석 배율 예상

분석할 시료를 증류수(DW)나 생리식염수 등의 희석수를 사용하여 제조합니다.
액상 시료의 경우 일정 부피를 채취하여 희석하고, 고체 시료의 경우 무게를 정확히 칭량하여 희석합니다.
(예를 들면, 시료가 배양액이라면 균질화한 배양액을 생리식염수에 넣어 일정 비율로 희석합니다.)
이렇게 제조한 1차 시료는 다단 희석(Serial dilution)을 통해 적절한 희석 배율로 만들어 줍니다.

여기서 ‘적절한 희석 배율’이라는 것이 중요한데, 이것을 위해 두 가지를 고려해야 합니다.
1) 분석할 시료 내 총균수 예상
시료가 어느 정도의 총균수를 갖고 있는지 이미 대략적으로라도 안다면 어느 정도 배율로 희석했을 때 몇 개의 균이 보일지 예상이 될 것입니다.
예를 들어 1 mL 당 1억(1 × 10⁸)개의 균체가 존재하는 시액을 주입할 경우 C 칸에 들어갈 균체 수 X는 다음과 같이 계산이 가능합니다.
1 × 10⁸ cells/mL= X cells ÷ 2.5 × 10^-7 mL   ▶   X = 4
따라서 1 mL에 1억개의 균체가 있는 시액을 분석하면 작은 네모 칸(C 칸) 하나당 평균 4개, 중간 네모 칸(B 칸) 하나당 평균 64개의 균체수가 예상됩니다.
2) 카운팅 챔버 네모 칸에서 관찰되는 균체의 밀도
이게 무슨 말이냐면, 직접 계수하는 균체의 개수가 너무 많아도, 너무 적어도 안된다는 것입니다.

[작은 세포(세균 등)]
제가 세균을 정량할 때 사용한 방식 기준으로 적합한 개수는 작은 네모 칸(C 칸) 하나당 약 4~8개 정도였습니다.

i) 균체 수가 너무 많을 경우: 균체끼리 서로 겹쳐 계수하기가 곤란해지며, 작업자에게 너무 많은 노동력을 요구하게 됩니다.
이렇게 균체의 낱개 구분이 어려울 정도로 너무 많은 경우는 희석을 더 해서 보는 방법 뿐입니다.
ii) 균체 수가 너무 적을 경우: 실험에 의한 오차가 다소 커질 수 있어 결과가 부정확합니다.
만약 오차가 걱정될 정도로 개수가 적다면 C 칸을 아주 여러 개를 세거나 B 칸을 활용하면 오차를 줄일 수 있습니다.
하지만 그렇게 되면 크기가 작은 세균 균체 대비 너무 넓은 영역을 관찰해야 하기 때문에 현미경 조작에 많은 노동력을 요구할 수 있습니다.

[세균보다 큰 크기의 세포(효모, 적혈구 등)]
C 칸에서 측정하기에 다소 큰 세포의 경우는 위 그림과 같이 처음부터 B 칸으로 확장해서 세는 것이 좋습니다.
개수가 조금만 늘어나도 균체 구분이 쉽지 않을 수 있기 때문이죠.

저의 개인적인 경험을 바탕으로 세포의 유효 개수를 언급했지만 사실 정해져있는 규칙은 없습니다.
오히려 세는 것이 가능만 하다면 균체 개수를 많이 가져갈수록 오차가 줄어들 수 있겠지요.
결론은, 시료 내 총균수를 예상하여 유효 개수를 측정하기 적합한 수준으로 시료의 희석 배율을 설정하는 원리를 이해하고 적용하는 것이 중요합니다.
만약 시료 내 균체 수를 대략적으로라도 알 수 없다면 여러 희석 배율의 시액을 제조하여 하나씩 측정해봐야 합니다.

시료 준비(희석)

앞서 계산해 본 결과 1 × 10⁸ cells/mL일 경우 작은 네모 칸(C 칸) 하나당 예상 균체 수가 평균 4개라는 사실을 알아냈기 때문에 이것을 이용하면 희석 배율 계산이 편리할 수 있습니다.
예시 1) 15억(1.5 × 10⁹) cells/mL로 예상   ▶   1.5억일 때 6개이므로 15억짜리 시료를 10배 희석하면 유효 범위!
예시 2) 300억(3 × 10¹⁰) cells/mL로 예상    ▶   3억일 때 12개이므로 300억짜리 시료를 100배 희석한 다음 2배 더 희석(총 200배 희석)하면 유효 범위!

이때, 희석은 다단 희석(Serial dilution)을 이용하는 것이 좋습니다.

시료의 물성에 따라 v/v 또는 w/v 등의 비율에 맞춰 희석합니다.
위 그림에서 액량(또는 무게)는 제가 예시를 든 것이므로 용질과 용매의 비율을 잘 계산해서 전체 양은 스스로 정하면 됩니다.
다만, 너무 적은 양으로 희석할 경우에는 균 현탁액을 아무리 잘 균질화 하더라도 채취하는 과정에서 편향이 생길 여지가 커지므로 저는 가능하면 최소 1 mL 이상의 용질을 채취하는 편입니다.

카운팅 챔버 세팅: 커버 글라스 고정

분석할 시액이 준비되면 이제 드디어 카운팅 챔버를 사용할 단계입니다.
카운팅 챔버로 분석하기 위한 준비에서 또 중요한 것 중 하나는 커버 글라스를 카운팅 챔버 위에 고정하는 것입니다.
만약 커버 글라스가 제대로 고정되어 있지 않고 들떠있을 경우 시료가 주입되는 부분의 부피가 부정확해지기 때문입니다.

위 그림과 같이 루프나 마이크로피펫 팁 등을 사용하여 양쪽 커버 글라스 거치 부분에 물을 묻혀줍니다.
그러고 나서 커버 글라스를 덮어주면 접촉면 부분이 물로 채워지게 되는데,  이 상태에서 약간 방치해 주어야 합니다.
물 양에 따라 적게는 1분에서 많게는 10분까지 방치해야 할 수 있습니다.
(실험 시간을 단축시킬 수 있는 최적의 물 양은 경험을 통해 확립할 수 있게 됩니다. 저의 경우 20 μL짜리 마이크로피펫으로 양쪽에 2~3방울씩 떨어뜨려 사용했었어요.)
이렇게 하면 커버 글라스가 카운팅 챔버에 밀착되어 고정이 됩니다.
이후 실험이 종료될 때까지 커버 글라스에 무리한 힘을 가하여 떨어지는 상황을 만들지 않도록 주의해야 합니다.

시액 주입

커버 글라스를 카운팅 챔버에 제대로 고정한 다음에는 희석을 통해 준비한 시액을 주입합니다.

아주 미량 주입되기 때문에 시액을 채취하기 전에 반드시 다시 한번 볼텍스 또는 격렬히 흔들어서 균질화해야 합니다.
이때, 너무 많은 양을 주입하면 범람(?)하는 사태가 벌어져 문제가 생기니 위 그림과 같이 시액 주입 부분이 채워질 만큼만 주입하도록 합니다.
그리고 다시 한번 강조하지만, 시액을 주입하는 피펫 팁으로 커버 글라스를 건드리지 않도록 주의해야 합니다.

균체 개수 측정

균체를 세는 격자무늬 구역은 딱 정해져 있지는 않습니다.
하지만 가장 작은 구역인 C 칸을 몇 개만 세고 결론을 내지는 않도록 주의해야 합니다.
균질화한 시액을 주입했다고는 하지만 균체는 용해되지 않는 덩어리이기 때문에 완전히 균등하게 퍼졌다고 할 수 없기 때문이지요.
따라서 너무 적은 칸만 세기보다는 일정 수 이상 칸의 균체 수를 세는 것도 중요합니다.

저는 개인적으로 20칸을 측정하는 방식을 많이 사용했습니다.
아래 그림은 측정하는 칸 구성의 예시입니다.

위 그림은 C 칸을 20칸 셀 때 측정 구역의 두 가지 예시입니다.
반드시 20칸을 세야 하는 것은 아닙니다만, 너무 적은 칸을 셀수록 오차가 늘어날 수 있다는 것을 고려해야만 합니다.

균체 크기가 크거나 개수가 많지 않은 경우에는 위와 같이 C 칸 16개 짜리, 즉 중간 크기인 B 칸을 통으로 5구역 세면 됩니다.

그러면 이제 진짜로 균체를 세보겠습니다.
시료 주입을 통해 준비가 완료된 카운팅 챔버를 현미경 대물렌즈에 놓고 계수하려는 격자무늬가 보이도록 배율과 초점을 조정한 다음 균체를 셉니다.
네모 칸의 균체를 셀 때는 경계선 위에 걸쳐서 위치한 세포들을 측정하는 규칙이 필요합니다.
그 규칙은 바로 두 변에 걸친 세포는 세고, 나머지 두 변에 걸친 세포는 세지 않는다는 것입니다.
그 이유는 경계선에 걸쳐있는 세포는 온전히 네모 칸 안에 있는 세포라고 할 수 없기 때문에 네 변에 걸쳐있는 세포를 모두 세면 개수를 과평가하게 되기 때문입니다.

예를 들면 위 그림과 같이 걸쳐있는 세포를 셀 구역과 아닌 구역으로 두 변씩 나눠주게 됩니다.
여기에서는 위 그림의 첫 번째와 같이 위쪽과 왼쪽의 변을 세는 것을 기준으로 실제 계수 방법을 설명하겠습니다.

B 칸은 가까이서 관찰하면 실제로는 위 그림과 같이 세 겹의 테두리로 이루어져 있습니다.
여기에서는 앞서 설명했듯이 네 모서리 부분을 세기로 했기 때문에 빨간 구역만 보면 되겠습니다.
그림이 작아 잘 안보여서 네 모서리 구역만 확대해서 오른쪽에 나타냈습니다.
– 1단계: 네모 칸 안에 쏙 들어가 있는 세포는 센다.
– 2단계: 계수 구역에 해당하는 위쪽과 왼쪽 변에 닿아 있는 세포는 센다. 밖으로 나간 부분이 비중이 더 크더라도 닿아있으면 포함한다.
– 3단계: 계수 구역에 해당하는 아래쪽과 오른쪽 변에 닿아 있는 세포는 세지 않는다. 안으로 들어온 부분이 비중이 더 크더라도 닿아있으면 제외한다.
이때 계수 구역이 세 겹의 테두리인 경우 가운데 선을 기준으로 판단합니다.

세균보다 크기가 커서 더 넓은 구역을 세야 하는 세포의 경우 일반적으로 B 칸을 다섯 개 센다고 했습니다.
계수 방법은 작은 칸을 셀 때와 동일합니다.

B 칸을 기준으로 안에 쏙 들어가 있는 세포 및 위쪽/왼쪽 변에 닿아있는 세포를 계수합니다.
위와 같은 방식으로 계획된 구역의 세포를 모두 세면 됩니다.
실험의 정확성을 위해 시료당 3번씩 채취하여 반복 실험하기를 추천합니다.

카운팅 챔버 계산식

앞부분에서 다룬 것처럼 주입한 시액의 단위 부피당 균체 수를 계산하려면 분석 결과를 해당 네모 칸들의 부피로 나눠주면 됩니다. 아래와 같은 식이 됩니다.
< 주입한 시액 1 mL당 균체 수(cells/mL) = 측정한 네모 칸의 균체 수(cells) ÷ 측정한 네모 칸에 해당하는 시액 부피(mL) >
그런데 우리가 알고 싶은 건 최초 시료 내의 균체 수이므로 희석한 배율을 곱해줘야 합니다.
최종적으로 정리하면, 시료 내의 균체 수는 아래와 같은 계산식으로 구하게 됩니다.

위 식의 적용을 예시 문제를 통해 확인해 보겠습니다.
[예시 문제 1] 세균 시료를 1,000배 희석한 시액을 주입하여 작은 네모 칸(C 칸) 20개 계수한 결과: 160개
시료 내 총균수(cells/mL) = {(160 cells ÷ 20칸) ÷ (2.5 × 10^-7 mL/칸)} ×10³ = 320억(3.2 × 10¹⁰) cells/mL
[예시 문제 2] 효모 시료를 400배 희석한 시액을 주입하여 중간 네모 칸(B 칸) 5개 계수한 결과: 85개
시료 내 총균수(cells/mL) = {(85 cells ÷ 5칸) ÷ (4 × 10^-6 mL/칸)} ×400 = 17억(1.7 × 10⁹) cells/mL

이렇게 세포를 카운팅 챔버로 직접 계수하는 방법을 알아보았습니다.
단순히 프로토콜만 보는 것보다는 각 과정에 대한 이해를 바탕으로 학습하시길 권장합니다.

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