[미생물 정량법 1탄 부록] 생균수 분석법(Plate count)의 실험 오차 사유 고찰

다단 희석 시 균질화의 수준

앞에서도 언급한 Vortex mixer는 일정량의 진동을 주어 내용물을 균질하게 할 수 있는 기본적인 실험 기기입니다.
희석 시에는 주로 이 기기를 사용하지만 만약 해당 기기가 없을 경우 손으로 Inverting (손으로 뒤집으며 섞어주는 행위)를 사용하여 균질화할 수도 있을 것입니다.
다단 희석은 일정 비율로 반복해서 희석해야 하고, 이때 모든 과정은 일관된 방식으로 진행해야 합니다.
따라서 가능하면 기기를 활용한 일관된 프로세스를 유지하기를 추천합니다.
다단 희석 과정에서 오차를 일으킬 수 있는 세부적인 요소들을 나열해보겠습니다.
– 최초 시료의 균질화
배양액 등의 액상 분석 시료 역시 제대로 균질화해서 채취해야 합니다.
만약 액체 시료가 아니라 분말 등의 고형 제제라면 채취 부분에 따른 오차가 없도록 잘 혼합하고 정확한 양을 칭량하는 것이 중요합니다.
– Mixing 시간
시료를 희석수에 넣고 Vortex mixer나 Inverting을 활용하여 균질화할 때 너무 짧은 시간 동안만 섞어주면 균질화 수준이 낮아 채취되는 균체량이 너무 적거나 많아질 수 있습니다.
분명히 용액을 흔들었음에도 균질화가 되지 않을 수 있는 이유는 여러 가지가 있을 수 있습니다.
균체가 무거운 편인 균주의 경우 가벼운 균주보다 더 많은 Mixing 시간이 필요할 수 있습니다.
또한, 균체 간 또는 균체와 용기 간 부착하는 성질이 있을 경우 이것을 충분히 떨어뜨리기까지 더 높은 전단응력(Shear stress)이 필요하므로 더 오랜 시간 Mixing 해야 할 수 있습니다.
– Mixing 후 1 mL 채취까지 걸리는 시간
희석을 위해 Mixing 후 1 mL을 채취할 때까지 너무 오랜 시간을 방치하면 금방 가라앉는 균주일 경우 균질화 정도가 떨어질 수 있습니다.
그래서 저 개인적으로는 희석 후 채취할 때 Mixing 후 3초 이내(늦어도 5초 이내)에 채취하는 편입니다.
– 희석 용액의 접종 시 채취 방법
원하는 비율로 희석한 용액을 페트리 접시에 분주할 때 저는 일반적으로 triplicate로 실험합니다.
즉, 한 가지 희석 용액을 3회 채취해서 각각의 플레이트에 넣어야 한다는 말입니다.
이때, ‘Mixing 후 채취’ 과정을 총 3회 반복해야 할지 아니면 Mixing은 한 번만 하고 신속하게 3회 채취해야 할지에 대해 한때 고민을 많이 했었습니다.
이후 수많은 분석 경험을 통해 10초 정도 이내에 빠르게 세 번 채취한다면 Mixing은 한 번만 해도 된다는 결론을 냈습니다.
이는 균주에 따라 달라질 수 있는 부분이니 참고만 하시기 바라며, 애매하다면 확실하게 전자의 방법을 택하면 됩니다.

균이 사멸하거나 증식하지 못하는 경우

적절한 희석수의 선택

희석에 걸리는 시간

도말봉의 온도(도말평판법)

배지의 온도(주입평판법)

오염(Contamination)이 발생하는 경우

기기 및 시약의 멸균

희석 용기의 뚜껑

희석 용기와 마이크로피펫 팁의 조화

위 그림과 같이 마이크로피펫 팁이 희석 용기에 얼마큼 들어가는지도 중요할 수 있습니다.
팁은 멸균이 되어 있지만 일반적으로 마이크로피펫은 멸균 상태가 아닌 경우가 많기 때문에 희석 용기 안쪽까지 마이크로피펫 본체가 들어가는 상황은 발생하지 않는 것이 좋습니다.
묻어있던 잡균이 낙하할 수도 있고, 희석 용기 벽면에 닿는 경우도 있기 때문입니다.
따라서 팁을 충분히 긴 제품을 사용하거나 희석 용기 키가 작은 것을 사용하는 등의 방식으로 마이크로피펫에 의한 오염 가능성을 소거할 수 있습니다.

마무리

이렇게 실험 과정 하나하나가 모두 오차의 요인이 될 수 있습니다.
결과를 도출하고 나서 오차의 원인을 추적할 때 중요한 고찰 요소들이 될 수 있을 것입니다.
이런 요소들을 모두 일정한 수준으로 수행할 정도로 숙련된다면 아주 정교한 수준의 생균수 분석 결과를 얻을 수 있을 것입니다.