그람 염색(Gram staining)은 세균 세포벽 구조의 특징을 이용하여 두 부류로 구분하는 염색법입니다. 미생물학의 기초 중 하나인 이 염색법의 원리와 실험 방법을 정리하겠습니다.
그람 염색의 기본 원리
펩티도글리칸과 크리스탈 바이올렛–아이오딘 결합체
펩티도글리칸(Peptidoglycan)은 세균의 세포벽을 구성하는 성분입니다.
크리스탈 바이올렛(Crystal violet)이라는 보라색 염색약은 세포를 염색하는 데 사용되는 색소입니다.
특히 크리스탈 바이올렛은 아이오딘(요오드, Iodine)과 결합하면 크리스탈 바이올렛–아이오딘 결합체(CVI complex)가 생성되는데, 세균 세포벽의 펩티도글리칸 구조는 이 결합체를 가두는 성질을 갖고 있습니다.
그람 염색은 이러한 세포벽의 특성을 이용한 염색법입니다.
세균 세포벽의 펩티도글리칸 두께
그람 염색은 세균에는 세포벽의 펩티도글리칸층이 두터운 것과 그렇지 않은 것이 있다는 사실을 이용한 염색법입니다.
세균 세포를 염색했을 때 펩티도글리칸층이 두꺼운 세균은 에탄올과 같은 유기용매로 세척하면 펩티도글리칸 분자 간격이 수축하여 CVI complex가 잘 씻겨 나오지 못하여 보라색 염색 상태를 유지하지만, 반대로 펩티도글리칸층이 얇은 세균에서는 쉽게 씻겨 크리스탈 바이올렛의 염색 효과가 사라지는 원리입니다.
이렇게 세포벽의 펩티도글리칸층 두꺼워 CVI complex로 보라색으로 염색되는 세균을 그람 양성균(Gram positive bacteria)이라고 부르며, 그렇지 못한 세균은 그람 음성균(Gram negative bacteria)이라고 부릅니다.
그람 염색의 실험 과정
1. 고정(Fixation)
1) 루프를 이용하여 균체를 채취하여 슬라이드 글라스 표면에 얇게 펴준다.
2) 슬라이드 반대편에 알코올램프로 화염을 살짝 가하여 열 고정한다.
→ 열을 너무 과하게 처리하거나 화염이 균에 직접 닿지 않게 주의한다.
2. 염색(Stain)
1) 고정된 균에 크리스탈 바이올렛 용액을 떨어뜨리고 1분간 둔다.
2) 흐르는 물로 헹궈준다.
→ 균에 직접 물을 쏘기보단 슬라이드를 비스듬히 기울여서 흘려보내거나 뒷면에 흘려주어 균체가 쓸려 내려가지 않도록 유의한다. 이는 이후 모든 세척 과정에서도 동일하다.
3. 매염(Mordant treatment)
1) 염색된 균에 아이오딘-아이오딘화 칼륨 용액을 떨어뜨리고 1분간 둔다(CVI complex 형성).
2) 흐르는 물로 헹궈준다.
4. 탈색(Decolorization)
1) 균에 에탄올(또는 아세톤)을 떨어뜨리고 10~30초간 둔다(CVI complex가 에탄올에 용해됨).
2) 흐르는 물로 헹궈준다(그람 음성균의 CVI complex는 함께 빠져나옴).
5. 대조 염색(Counterstain)
1) 사프라닌(Safranin O) 용액을 떨어뜨리고 30초~1분간 둔다.
2) 흐르는 물로 헹궈준다.
6. 관찰(Observation)
물기를 없애고 현미경으로 관찰한다.
그람 염색 결과
현미경 관찰
염색한 균을 현미경으로 관찰하면 위와 같이 그람 양성균(좌)과 그람 음성균(우)이 각각 보라색과 분홍색으로 염색된 것을 확인할 수 있습니다.
그람 염색 실험 방법 고찰(염색이 잘 안되는 이유)
염색이 제대로 관찰되지 않는 이유는 여러 가지가 있습니다.
– 균을 너무 적은 양을 채취하거나 고정을 제대로 하지 않아 씻겨 나감
– 세포가 생육 곡선(Growth curve)상의 대수기로부터 너무 많이 지남
– 고정 시 열처리를 너무 오래 했거나 균이 불에 직접 닿아 세포벽이 손상됨
– 균 종류에 따라 세포벽 특성이 다소 다르므로 염색 정도가 달라짐(이 경우 염색 시간을 조정할 필요 있음)
– 기본적인 시약 처리 시간을 지키지 않음(가장 흔히 발생하는 원인)
세포벽 구조 이해의 중요성
그람 염색에 의해 구분되는 양성균과 음성균은 펩티도글리칸층의 두께 외에도 다른 세포벽 구성상 차이가 존재합니다.
그러한 세균 세포 껍질(Bacterial cell envelop)의 차이는 균이 갖는 부착력, 스트레스 저항성, 병원성 등의 각종 특성을 결정하며, 이러한 성질을 이해하면 균을 활용하거나 제거하기 위한 전략을 수립할 수 있습니다.
참고) 그람 양성균과 음성균의 예시
그람 양성균: Lactobacillus (유산균), Bacillus subtilis (고초균), Staphylococcus (포도상구균) 등
그람 음성균: Escherichia coli (대장균), Salmonella (살모넬라균), Pseudomonas aeruginosa (녹농균) 등
그람 염색 실험 방법 한 컷 요약
