환원당과 비환원당의 정량 방법(DNS assay)

 

DNS assay의 원리

노란색을 띠는 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS)는 환원제에 의해 3-Amino-5-nitrosalicylic acid로 환원되면 원래의  붉은색(또는 적갈색)으로 변하게 됩니다.
따라서 환원당의 농도에 따라 붉은색의 진한 정도가 달라지게 되는 원리를 이용하여 환원당의 양을 정량할 수 있습니다.

준비물

기기 및 기구

Water bath / Spectrophotometer / Vortex mixer / Micro tube (1.2 ~ 1.5 μL) 또는 Test tube (10 ~ 15 mL) / Floating rack / Micropipette

시약

DNS 용액(Dinitrosalicylic acid reagent, 1%)
3,5-Dinitrosalicylic acid (10 g), Sodium sulfite (0.5 g), Sodium hydroxide (10 g) in DW (1 L)

로셸 염(Rochelle salt)
Potassium sodium tartrate (400 g) in DW (1 L)

표준 용액(Standard solution)
측정하기를 원하는 당(400 ppm = 0.04%)
※ 본 포스팅에서는 환원당은 포도당(Glucose), 비환원당은 설탕(Sucrose)을 사용함

HCl (Hydrochloric acid) concentrate solution → 비환원당 정량에만 사용
시약 원액(37%) 사용

KOH (Potassium hydroxide) solution → 비환원당 정량에만 사용
Sodium hydroxide (5 N = 20%) 용액 제조
※ 시약 칭량하여 적당량의 DW에 넣어 용해시킨 다음 추가로 DW 첨가하여 총량 맞춤

환원당 정량

유효한 표준 곡선을 도출하기 위해서는 제조한 DNS 용액으로 측정할 수 있는 표준 용액의 범위를 알아야 합니다.
따라서 DNS assay를 수행하기 전에 표준 용액을 대략적인 농도 별로 희석하여 측정한 다음 제대로 측정되는 구간을 확인해야 합니다.
여기에서는 그러한 예비 실험은 생략하고 개인적으로 측정했을 때의 경험을 바탕으로 본 실험만 기술하겠습니다.

전체 반응 용액의 부피는 각 물질의 비율만 프로토콜대로 맞춰준다면 실험자가 설정하기 나름입니다만, 여기서는 Micro tube를 사용한 약 1 mL 수준의 반응 부피 기준으로 설명하겠습니다.

1. 표준 용액 및 시험 물질의 농도 별 시액 제조

1) 표준 용액
미리 준비해 놓은 400 ppm (0.04%) 표준 용액을 아래와 같은 비율로 희석하여 농도 별 시액을 제조한다(2 mL 기준).

2) 시험 물질
측정할 물질을 예상되는 농도 기준으로 표준 용액 농도 범위에 들어갈 수 있도록 적정 비율로 희석한다. 예를 들어, 당 농도가 1% 정도로 예측된다면 10배, 100배, 1000배 희석 용액을 준비한다.

2. DNS assay 반응

1) Water bath의 온도를 미리 90℃로 설정하여 높여 둔다.
2) Micro tube에 DNS 용액을 500 μL 넣어 표준 용액 개수만큼 준비한다.
3) 각 Micro tube에 농도 별 표준 용액을 500 μL씩 넣고 균질화한다.
4) 각 Micro tube를 Floating rack에 끼워 90℃로 설정해 둔 Water bath에서 5분간 처리한다. 이때, Micro tube의 뚜껑이 열려 용액이 손실되지 않도록 잘 고정한다.
5) 로셸 염을 200 μL 첨가하여 색을 안정화한다.
6) Spectrophotometer를 사용하여 575 nm 흡광도를 측정한다.
※ 만약 붉은색으로 잘 변색하지 않을 경우 열처리 시간을 5~10분 추가하거나 DNS 시액에 Phenol을 0.2% 첨가하여 재반응한다.

3. 농도 계산

1) [표준 곡선] 농도와 흡광도 간의 표준 곡선을 작성하고 선형 회귀 분석을 통해 R²값이 0.99 이상 되는지 확인한다. (흡광도는 0.2 ~ 0.8 사이의 값만 사용하는 것이 기본이지만, 다소 벗어나더라도 직선성을 만족한다면 사용한다. 만약 직선성이 제대로 그려지지 않을 경우 재반응하거나 표준 용액 농도 범위를 수정한다.)
2) [계산식 수립] 선형 회귀선의 Y절편과 기울기를 확인하여 흡광도를 통해 당 농도를 계산하는 계산식을 작성한다.
3) [농도 계산] 시험 물질의 흡광도를 계산식에 넣어 당 농도를 도출한다. 이때, 여러 희석 용액 중 표준용액의 흡광도 범위에 해당하는 희석 배율의 결과를 사용한다. 만약 표준 용액의 흡광도 범위보다 높은 경우 반응액을 추가 희석하여 측정하여 희석 배율에 반영할 수 있겠지만, 바람직하게는 한 번에 유효 범위에 포함되게 하는 것이 좋다.

비환원당 정량

DNS assay는 환원당과의 반응을 통해 발색 반응하므로 기본적으로 비환원당을 정량하지 못합니다.
하지만 비환원당이 가진 결합을 가수분해한 다음 분석할 수 있습니다.
따라서 앞서 기술한 환원당의 분석 과정 앞부분에 다음과 같은 전처리가 추가됩니다.

비환원당의 전처리 방법

1) Water bath의 온도를 미리 90℃로 설정하여 높여 둔다.
2) [산 처리] 설탕 용액 2 mL 기준으로 37% HCl을 40 μL 첨가한 다음 균질화하여 90℃에서 5분간 처리한다.
3) [pH 중화] 5 N KOH을 100 μL 첨가한 다음 균질화하여 중화한다.

DNS assay는 기본적으로 알칼리 조건에서 진행되기 때문에 산으로 가수분해한 후에는 반드시 중화를 해줘야 합니다.
비환원당은 위 방법으로 전처리한 다음 나머지 분석은 환원당 정량 방법과 동일하게 진행하면 됩니다.

마무리

환원당과 비환원당을 정량하는 방법에 대해 알아보았습니다.
DNS assay는 반응에 영향을 줄 수 있는 Phenol의 첨가 여부, 열처리 시간, 환원당의 가수분해 정도, 유효한 농도 범위 설정 등을 고려하여 실험한다면 매우 정확한 당 측정이 가능합니다.

관련 포스트

포도당 당량(Dextrose equivalent, DE) 개념 완벽 정리

 

참고 자료

[1] Biocyclopedia
[2] YouTube: Quick Biochemistry Basics, Reducing sugar by DNS method
[3] SUCROSE ASSAY (Professor Nam Sun Wang’s Home Page)